In 1822 werd hij geneesheermajoor in het Nederlands Oost-Indische leger met als standplaats Batavia. Daar trok hij al snel de aandacht van de Gouverneur-generaal. Siebold leek de ideale persoon om naar Japan te sturen, een land met een centrale plaats in de veranderende wereldpolitiek. Japan was tot dat moment een onbekende mogendheid, met strikt gesloten grenzen. Handel was toegestaan, maar was beperkt tot een handelspost op het speciaal voor dit doel gebouwde kunstmatige eiland Deshima.

In 1823 landde Siebold op Deshima met de opdracht informatie te verzamelen over Japan, de handel met Japan en het Japanse politieke systeem. Buitenlanders mochten Deshima niet verlaten, maar als arts stonden hem nog andere kanalen open. Na het genezen van een invloedrijke lokale ambtenaar werd hem toegestaan een kleine kliniek buiten de handelspost te openen en huisbezoeken af te leggen bij Japanse zieken.

Direct na aankomst legde hij contact met Japanse medici en natuurwetenschappers. Sommigen van hen konden de Nederlandse taal spreken en schrijven en werden Rangakusha - letterlijk: Holland-deskundigen - genoemd. Het huis van Siebold groeide al gauw uit tot een centrum van ontmoetingen, lezingen en discussies, waarbij de gastheer werd erkend en gewaardeerd als een expert op het gebied van de Westerse wetenschap. Geen wonder dat in die jaren het Nederlands werd gezien als 'het Latijn van het Oosten'!

Ook als arts verwierf hij een goede reputatie. Hij legde veel huisbezoeken in de omtrek af. Hij mocht hiervoor geen betaling ontvangen, maar in plaats daarvan kreeg hij vaak geschenken van dankbare patiënten. Zo werd de basis gelegd van zijn etnografische verzameling. In navolging van Jan Cock Blomhoff (1779-1853), tussen 1818 en 1823 de Nederlandse commandant van Deshima, en boekhouder Johannes van Overmeer Fisscher (1800-1848), wist hij een groot aantal huishoudelijke voorwerpen, prenten, materialen en ambachtelijke kunstvoorwerpen te verwerven.

Siebold richtte zich op het verzamelen van planten, dieren en zaden en allerlei gebruiksvoorwerpen en nam kunstenaars in dienst om dieren, voorwerpen en gebruiken op papier vast te leggen. Siebold verzamelde tijdens zijn uitstapjes ook zoveel mogelijk natuurlijk materiaal. Zijn leerlingen namen voor hem planten, dieren en gesteenten mee en hij huurde drie jagers om bijzondere dieren voor hem te verzamelen.

In 1825 kreeg hij vanuit Batavia twee assistenten toegewezen: de apotheker Heinrich Bürger en tekenaar C.H. de Villeneuve. Bürger was een belangrijke hulp bij het verzamelen, en vanaf 1828 was hij Siebold's opvolger. Het natuurhistorisch materiaal kwam, verspreid over de jaren van Siebold's verblijf in Japan, in 4 zendingen naar Nederland. De laatste zending nam hij zelf mee toen hij eind 1829 Japan gedwongen verliet. Bürger bleef op Deshima en stuurde in de jaren daarna nog eens drie vrachten. In Nederland vormen de zendingen, die alles bij elkaar circa 10.000 voorwerpen omvatten, tot op de dag van vandaag de Japanse collecties van het Nationaal Natuurhistorisch Museum Naturalis en het Nationaal Herbarium Nederland.

Aan de hand van de grote hoeveelheid dieren die Siebold en Bürger naar Nederland stuurden, konden de zoölogen Temminck (Coenraad Jacob, 1778-1858), Schlegel (Hermann, 1804-1884) en De Haan (Wilhelm, 1801-1855) de Japanse fauna beschrijven. Toen hun onderzoek werd gepubliceerd in de "Fauna Japonica" (verschenen tussen 1833 en 1850), maakte dit werk de Japanse fauna van vrijwel onbekend in één keer tot de best beschreven fauna van alle niet-Europese landen.

Na een maandenlange reis naar Edo, het huidige Tokyo, waar Siebold naast vele objecten ook in het bezit van landkaarten van Japan kwam, zou hij bij terugkomst op Deshima direct naar Java vertrekken. De voorwerpen werden alvast naar Deshima verstuurd. De landkaarten werden echter ontdekt en Siebold werd ervan beschuldigd te spioneren voor de Russische staat. Het bezit van landkaarten was immers streng verboden. Na een periode van huisarrest en onderzoeken werd Siebold in oktober 1829 voorgoed uit Japan verbannen. Op dat moment wist hij nog niet dat deze ban later zou worden opgeheven.

Delen van zijn collectie werden tot dan toe in Leiden, Gent, Antwerpen en Brussel bewaard. Siebold besloot zich in Leiden te vestigen aan het Rapenburg nummer 19. Vanaf 1831 stelde Siebold zijn collectie open voor het publiek en na enig aandringen gaf Koning Willem I gevolg aan zijn al eerder geformuleerde belangstelling voor de Siebold collectie. De Haagse collectie 'Koninklijk Kabinet van Zeldzaamheden', de collecties van Blomhoff en van Overmeer Fisscher, en de collectie van Siebold, werden uiteindelijk samengevoegd. Siebold's collectie werd daartoe door de staat aangekocht en het nieuwe museum werd de voorloper van het huidige Wereldmuseum Leiden.

Siebold bleef een belangrijke rol vervullen als adviseur over Japanse zaken. In 1859 reisde hij nog een maal naar Japan.